酵母文库筛选原理「酵母文库构建」

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“自1989年Field等人建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白相互作用的系统以来,酵母双杂交系统已经越来越多的应用于鉴定新的蛋白与蛋白相互作用,鉴定蛋白级联底物以及鉴定突变对蛋白与蛋白结合的影响等。有文献统计,目前已知的蛋白质相互作用至少有一半是通过酵母双杂交实验发现的！” 而文库筛选结果直接由文库质量的好坏所决定，构建出高质量的文库是得到好的筛选结果的关键因素。

我们拥有多年的文库构建经验，已完成数千个各类文库构建，所采用的技术以及试剂盒均为市场上质量最好的文库构建试剂，保证所构建的每一个文库各项指标均为市场上最高标准，我们构建文库的成功率为98%以上。关于我们的文库构建产品，我们承诺的指标如下，各项指标在国内各家公司里是最高的。

上海宝吉结合多年的文库构建经验，强势推出“All-Direct”文库构建技术，我们的产品较其他构建方法（主要有takara的SAMRT方法和invitrogen的gateway方法），技术和质量上都具有极大的优势。

一、产品质量标准与报价:：:

关于我们的文库构建产品，我们承诺的指标如下，各项指标在国内各家公司里是最高的:

原始文库库容量大于1*10^7CFU；

平均插入片段大于1200bp；

克隆阳性率大于95%。

二、技术特点与技术优势:

1.我们是采用同源重组的方法构建文库，没有经过任何的内切酶切割和连接过程，确保不会出现基因被酶切切断的情况，能够保证基因的完整性，而Clonetech的是用酶切连接的方式构建的。

2.由于我们采用的是重组的方式把cDNA重组到载体上，相对clonetech的SMART的T4连接酶的方法效率要高的多，我们承诺原始库的库容量在1*10^7以上。而且重组的方式假阳性很低，我们这里有的客户一次测3万个克隆，都没有出现一个空载的情况，我们承诺阳性率大于98%，这是酶切连接的方法远远无法比拟的。

3.Clonetech的SMART方法是用PCR的方法合成第二链的，由于PCR的选择性抑制及竞争性扩增，这样就会造成基因冗余度非常高，低丰度的基因PCR扩增不到，会丢失掉，长片段的基因也会丢失掉，另外会造成重复序列非常多，特别是起始的RNA样本量少的情况（比如5ug RNA以下就需要进行15个循环以上的PCR扩增，大大降低文库质量),，大大降低文库包含的基因数量，而我们的cDNA合成方法是用多种酶在16度恒温的条件下直接合成第二链的，这样就完全忠于样本自身的基因情况，不会人为的改变样本内的基因情况以及基因大小，大大提到文库的质量。

4.我们是采用的一种高质量的反转录酶，该反转录酶是公认的最好的反转录酶，较clonetech的反转录酶具有反转录温度高（55摄氏度反转，clonetech的反转录酶是使用42度反转，较高的温度可以打开RNA的二级结构，可以获得更长的cDNA），反转录效率和cDNA长度要好的多。我们承诺文库的平均插入片段在1.3Kbp以上，最低长度也在1Kbp以上，而clonetech的SMART方法构建出来的文库一般只有几百BP。

文库构建流程:

1.RNA提取

2.mRNA提取

3.cDNA的酶促法合成

4.cDNA连接接头

5.cDNA按长度分离

6.cDNA与酵母双杂交文库载体(pGADT7或者pDEST22)进行all-direct重组

7.重组产物电转化

8.文库检测以及质粒提取

五、服务时间:

25个工作日内，如需转化酵母延长15个工作日。

备注1：该酵母文库可以选择增加均一化处理步骤，我们使用DSN法均一化方法，可以构建出高质量的均一化酵母杂交文库，可以大大减少后续酵母筛选的工作量和筛选效率等。

六、材料要求:

客户构建指定的酵母双杂交cDNA文库，由客户提供组织、细胞或总RNA给我们即可：

细胞样本：细胞数量大于1*10^7

动物样本：大于1g

植物样本：大于2g

总RNA：大于200ug

七、客户案例:

目前我们已经成功完成数千个不用样本的文库构建，主要客户为中国科学院上海植物生理生态研究所、上海交通大学、浙江大学、浙江省农科院、山东省农科院等多家单位完成酵母双（单）杂交文库构建服务，物种包括人、小鼠、大鼠、水稻、拟南芥、牡丹、稻飞虱、苹果、油菜、小麦、贝壳、葡萄、真菌等。

八、文库筛选:

我们是国内极少数能同时提供文库构建和文库筛选的公司，对于酵母双杂交筛选服务，您只需要提供诱饵基因序列即可，我们会进行以下工作，筛选的报价为3万元整:

1.诱饵载体的测序验证以及构建到双杂交筛选载体上

2.诱饵基因的自激活检测，检测通过后继续下一步实验。

3.诱饵质粒转化酵母细胞，验证合格后再转化文库质粒

4.酵母筛选和3AT条件优化

5.筛选结果的测序

6.筛选结果的回转验证

7.筛选结果递交:包括筛选报告，筛选结果的测序结果和blast结果，筛选结果克隆的质粒实物。

九、FAQ:

9.1.如何选择合适的文库构建方法进行建库？

※ 我们是市场上唯一可以同时提供3种文库构建方法的公司，这也足以看出我们公司的技术实力。

※ 3种方法的比较如下：

1) Clonetech 的SMART方法，该方法基本是被淘汰的，我们上文有详细的技术比较，其唯一的好处就是RNA的起始量可以很小，一般只需要几ug即可，该方法成本很低，一般不建议选择。

2) Invitrogen的方法，该方法质量上较SMART方法要好很多，其对试剂的质量要求也很高，必须全部使用invitrogen的原厂试剂。我们全部使用invitrogen公司试剂进行构建，且做了一些技术改进，提高了文库质量。该方法对起始的RNA要求较高，建议起始用量是大于200ug。但该方法有一个严重的缺点，就是需要进行两次重组才能得到酵母文库，而多一次重组就会多一次文库扩增过程，会严重影响文库质量。在上文中有详细的技术比较和介绍。

别的使用该方法建库的公司，只能完全使用商业化的试剂盒构建文库，没有做任何改进。且由于进货渠道的原因，试剂盒内的有些试剂他们是买不到的，质量就会大打折扣。比如DH10B 电转化感受态细胞，这个感受态细胞转化效率比国产的高出100倍以上。这个感受态细胞需要具有一堆的海关批文才能买到，其他公司由于没有相关资质，是无法进口的，据我们了解，国内某公司居然会用化学转化细胞代替电转化，质量影响巨大。

3) All-Direct专利方法，这个是我们的独家专利方法，是在invitrogen方法上做了重要改进，保留了其优点（不用PCR扩增，文库保真度高），去除了其需要经过两次重组的缺点，大大提高文库质量。平均长度较invitrogen方法可以提高200bp，库容量可以提高10倍以上。该方法对RNA的要求量和invitrogen方法一样。

9.2.宝吉生物提供的酵母双杂文库有哪些产品内容？

※ 我们提供的文库产品，包含了文库质量（大于200ug）以及大肠杆菌文库甘油菌。同时可以选择提供转化到酵母细胞的文库甘油菌，我们会提供100只转化到酵母细胞的文库甘油菌，可以做100次的文库筛选。

※ 其中文库质粒可以使用共转的方法进行文库筛选，酵母细胞文库甘油菌可以使用maiting的方法进行文库筛选，根据老师的实验习惯可以自由选择，结果没有任何差异的。

9.3.如何检测文库质量？

※ 对于文库的质量，一个简单的金标准就是，样本内的所有基因都在文库里，且基因要有一半以上的全长基因，这个文库就是合格的。

※ 对于文库的检测，可以针对我们交付的产品，做以下几个方面的检测：

根据老师的样本信息，选择3-5个低拷贝的基因，设计合成引物，以我们提供的文库质粒为模板，进行PCR扩增，如果低拷贝的基因都能扩增出来，高拷贝的就不会丢失，文库质量即可以判断为合格。

※ 对于我们提供的大肠杆菌文库甘油菌，可以进行梯度稀释后铺板培养，第二天计算库容量，同时挑取单克隆进行PCR扩增和测序检测，以判断插入片段长度和空载率。

9.4.如何评价文库质量？

※ 文库质量的关键指标，主要是文库库容、空载率及插入片段平均长度。

※ 文库的原始库容肯定是越高越好，我们公司承诺的是大于1*10^7的库容量，这个是原始库容量，也就是没有经过任何扩增过程，直接转化出来的库容量。比其他公司承诺的1*10^6的库容量要高10倍以上，下面详细解释下库容量的高低对文库质量的影响:

※ 生物样本，除了低等生物，目前研究比较多的物种，比如人，大鼠，小鼠，其基因数在5*10^4左右，文库至少得100倍覆盖，也就是库容至少需要5*10^6以上。

※ 对于植物样本，其基因数量比人的大很多，比如水稻样本，其基因数量为人的2-3倍，小麦样本，其基因数量为人的5-6倍，这样就需要更多的文库库容量。对于水稻样本，需要覆盖100倍的基因数，要求的文库原始库容量是大于1*10^7以上。市场上别的公司提供的文库最多只能覆盖10倍左右，这么低的覆盖度，必然造成大量基因的丢失。

※ 对于有的公司宣传的，库容量不是越高越好，这绝对是不负责任的忽悠，为自己的文库质量不合格找不合理的借口。

※ 对于插入基因长度，别的公司一般平均长度就在800bp左右，我们公司可以承诺做到1200bp以上，这个差距是巨大的，下面再 详细介绍下插入片段长度对文库质量的影响：

※ 一般的一个功能基因，其一般长度会在200个氨基酸以上，也就是编码区在600bp碱基以上，装入文库的基因，除了编码区，还会有5’UTR区，3‘UTR区以及polyA区域，这几个部分加起来，基因的长度一般至少会在1000bp以上。由于文库是个混合物，会存在竞争性抑制，短的基因过多，势必会影响长度基因的比例，以及长的基因的表达丰度。

※ 我们的文库产品，插入片段平均长度会在1200bp以上，最短的会在1000bp左右。对于文库筛选，不是说只要有基因的一个片段就可以了，蛋白质的功能需要多种因素的参与，如果插入基因过短，筛选到的结果只是一个基因片段，甚至是靠近polyA的一小段基因，这个结果的可行度在哪里？基本都可以认为是假阳性的结果的。

※ 对于有些公司宣称的，文库的基因插入片段不是越长越好，其实是对客户的极其不负责任和不合理的忽悠，只是因为自己没有技术做到更长的片段长度，而找的理由。

9.5. Mating和共转两种筛库方法哪种好？

共转和maiting两种方法，结果是一样的，只是一个文库质粒转到酵母细胞的方法，对于后续的文库筛选没有任何区别的，可以根据老师的实验习惯，自由选择的。

十、客户文章示例

核蛋白酵母双杂交文库客户文章示例：

【1】Yeast-2-Hybrid data file showing progranulin interactions in human fetal brain and bone marrow libraries[J],ata in Brief, Volume 9, December 2016, Pages 1060-1062

【2】Zhenhai Yu, Yingying Ge, Lei Xie,et al. Using a yeast two-hybrid system to identify FTCD as a new regulator for HIF-1α in HepG2 cells[J],Cellular Signalling, Volume 26, Issue 7, July 2014, Pages 1560-1566

【3】Zhanyang Yu,1 Ning Liu,1 Yi Wang,2 Xiaokun Li,et al. Identification of Neuroglobin-interacting Proteins Using Yeast Two-hybrid Screening. Neuroscience. 2012 Jan 3; 200: 99–105.

【4】Cui LG, Shan JX, Shi M, et al. DCA1 Acts as a Transcriptional Co-activator of DST and Contributes to Drought andSalt Tolerance in Rice. PLoS Genet. 11, e1005617 (2015).

【5】Jing Ning, Baocai Zhang, Nili Wang, Increased Leaf Angle1, a Raf-Like MAPKKK That Interacts with a Nuclear Protein Family, Regulates Mechanical Tissue Formation in the Lamina Joint of Rice. The Plant Cell, Vol. 23: 4334–4347, December 2011.

【6】Raksha Singh, Mi-Ok Lee, Jae-Eun Lee, Jihyun Choi, Rice Mitogen-Activated Protein Kinase Interactome Analysis Using the Yeast Two-Hybrid System. Plant Physiology, September 2012.Vol.160,

【7】X.F.Zha， M.Zhao， C.Y.Zhou, H.Z.Guo. Analysis of interaction between Bmhrp28 and BmPSI in sex-specific splicing of Bombyx mori Bmdsx gene. Genetics and Molecular Research 13 (3): 5452-5462 (2014)

【8】Chao Zhang, Rongchao Ge, Junwen Zhang, Identification and Expression Analysis of a Novel HbCIPK2-Interacting Ferredoxin from Halophyte H. brevisubulatum.PLOS. December 4, 2015.

酵母单杂交文库客户文章示例：

【1】Nobutaka Mitsuda,Miho Ikeda,Shinobu Takada,et al.Efficient Yeast One-/Two-Hybrid Screening Using a Library Composed Only of Transcription Factors in Arabidopsis thaliana.Plant Cell Physiol (2010) 51 (12): 2145-2151.

【2】Chang-Qing Yang1, Xin Fang1, Xiu-Ming Wu1, et al. Transcriptional Regulation of Plant Secondary Metabolism. Journal of Integrative Plant Biology 2012, 54 (10): 703–712

【3】Zejun Huang, Zhijin Zhang, Xiuling Zhang,et al. Tomato TERF1 modulates ethylene response and enhances osmotic stress tolerance by activating expression of downstream genes. FEBS Letters.Volume 573, Issues 1–3, 27 August 2004, Pages 110-116

膜蛋白双杂交文库客户文章示例：

【1】Yasuyuki Nakamura, Jun Ishii, Akihiko Kondo. Rapid, Facile Detection of Heterodimer Partners for Target Human G-Protein-Coupled Receptors Using a Modified Split-Ubiquitin Membrane Yeast Two-Hybrid System.PLOS one. June 2013 , Volume 8 ,Issue 6.

【2】Zhe Ma, Hui Zhang, Junxi Zheng. Interaction between M-Like Protein and Macrophage Thioredoxin Facilitates Antiphagocytosis for Streptococcus equi ssp. Zooepidemicus.PLOS one. February 2012 ,Volume 7, Issue 2.

【3】Pratima Pandey and Singh Harbinder. The Caenorhabditis elegans D2-like dopamine receptor DOP-2 physically interacts with GPA-14, a Gαi subunit. Pandey and Harbinder Journal of Molecular Signaling 2012.

中文论文：

【1】张云云，周 君， 李 晔. 可口革囊星虫(Phascolosoma esculenta)酵母双杂交文库和铁结合蛋白真核表达载体的构建. 海洋与湖沼,44卷，第6期。

【2】欧阳沫， 唐潇，黄惜，袁红梅。巴西橡胶树ＨｂＩＣＥ１ 基因酵母双杂交诱饵载体的构建及互作蛋白的筛选。植物科学学报，2016，34(2): 255~262.

【3】岳珊珊，夏来新。酵母双杂交筛选与果蝇C(2)M相互作用的蛋白。遗传，2015.11,37(11)

【4】专利：一种结合串联重复序列（TTTACAC）5的Dof蛋白质